ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ЩФ Набор реагентов для цитохимического определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ:

Приготовление рабочих растворов.

Приготовление 0,05 М буферного раствора:

К содержимому флакона маточного раствора пропандиолового буфера добавить 70мл дистиллированной воды (проверить рН 9,6 – 9,7), при необходимости добавить 3,5 мл 0,1 Н соляной кислоты. Хранить в холодильнике.

Приготовление 2% раствора метилового зеленого:

Содержимое флакона метилового зеленого растворить в 100 мл дистиллированной воды и вылить в делительную воронку. В ту же воронку залить 50 мл хлороформа. Смесь взболтать несколько раз в течение дня и оставить на ночь для экстрагирования метилового фиолетового. Краска метиловый зеленый нестойка, под влиянием света и кислорода воздуха часть метилового зеленого превращается в метиловый фиолетовый, который должен быть экстрагирован хлороформом и удален.

Приготовление рабочего раствора:

Содержимое флакона с альфа-нафтилфосфатом натрия растворить в 5 мл 0,05 М буферного раствора и добавить содержимое флакона прочного синего РР. Хорошо перемешать. Готовится перед употреблением и фильтруется прямо на стекла. Рабочий раствор стабилен в течение 15 минут. Раствор имеет красно-коричневый цвет и быстро становится мутным, но мутность не влияет на окраску.

Приготовление мазков:

2-3 мазка сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного или покровного стекла следующим образом. Взяв стекло за длинные края, прикоснуться его поверхностью (отступив на 0,5 - 1 см от узкого края) к капле крови (но не к коже). Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к стеклу с каплей слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей. Выждать до тех пор, пока капля расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как многие клетки могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток. Затем надо уложить предметные стекла мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Фиксация препаратов:

Приготовленные препараты положить на лотки, выстланные фильтровальной бумагой, и высушить при комнатной температуре в течение 15 – 30 минут. Высушенный на воздухе препарат зафиксировать в 10% спирт-формалиновой смеси в течении 20 секунд, после чего промыть проточной водой в течение 10 секунд.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

Непосредственно на мазок через воронку с фильтровальной бумагой нанести столько рабочего раствора, чтобы мазок был покрыт полностью. Оставить для реакции на 15 минут. Промыть мазки в проточной воде 1 минуту. Докрасить мазки 2% водным раствором метилового зеленого в течение 15 мин. Промыть мазки в проточной воде 1 минуту. Высушить окрашенный препарат на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении. Микроскопировать с иммерсионной системой.

Результаты окраски: щелочная фосфатаза дает положительную реакцию в виде гранул коричневого цвета в цитоплазме лейкоцитов.

Учет результатов реакции

При цитохимических реакциях необходимо определить характер цитохимических реакций - слабая, умеренная, интенсивная, с указанием процента положительно реагирующих клеток.

С этой целью применяют полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Принцип его заключается в оценке интенсивности окраски и числа положительных гранул при анализе 100 клеток:

0 - отсутствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция;
+ - слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ - диффузная окраска цитоплазмы, наличие умеренного числа гранул;
+++ - интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски цитохимической реакции проводят расчет результатов в условных единицах или СЦК.

Вычисление среднего цитохимического коэффициента по формуле Astaldi и Verga:    3хС+2хВ+А

 , где

А – количество клеток со слабоположительной реакцией:
В – количество клеток с умеренно положительной реакцией;
С – количество клеток с резко выраженной реакцией.

При этом показатель активности реакций в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а СЦК – от 0 до 3,00.