ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО Набор реагентов для цитохимического определения миелопероксидазы в лейкоцитах

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ:

Приготовление фиксатора (10% спиртовой раствор формалина) (не входит в состав набора):

1 мл формалина смешивают с 9 мл 96º этилового спирта. Как прозрачный, так и мутный, молокообразный раствор формалина одинаково пригоден. Полученный 10% раствор формалина хранится при температуре от +2°С до +8°С.

Приготовление рабочего раствора:

Для кат.№ 442: смешать содержимое одного флакона с орто-толидином с 2 мл дистиллированной воды. Хорошо взболтать и перед применением добавить пипеткой 1 каплю 3% перекиси водорода.

Для кат.№ 442Б: смешать содержимое одного флакона с бензидином с 2 мл дистиллированной воды. Хорошо взболтать и перед применением добавить пипеткой 1 каплю 3% перекиси водорода.

Приготовление рабочего раствора красителя по Романовскому:

краситель по Романовскому, входящий в состав наборов, развести дистиллированной водой в соотношении 1:10. Приготовленный раствор стабилен в течение 6 часов.

Приготовление мазков крови и костного мозга:

2-3 мазка крови или костного мозга сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом: на сухое предметное стекло, ближе к короткой стороне наносят пипеткой небольшую каплю крови. Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”.

После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток.

Фиксация препаратов: приготовленные препараты положить на лотки, выстланные фильтровальной бумагой и высушить при комнатной температуре в течение 15 – 30 минут. Высушенный на воздухе препарат зафиксировать в спирт-формалиновой смеси в течение 15 секунд, после чего промыть проточной водой в течение 10 секунд.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

1.     Предметные стекла с зафиксированными препаратами поместить на штатив для окраски;
2.     Налить на них свежеприготовленный рабочий раствор с только что добавленной в него 3% перекисью водорода;
3.     Оставить на 15-20 минут при комнатной температуре;
4.     Промыть дистиллированной водой в течение 10 секунд;
5.     Промокнуть фильтровальной бумагой;
6.     Докрасить рабочим раствором красителя по Романовскому в течение 15-20 минут;
7.     Промыть стекла в проточной воде 10 секунд;
8.     Высушить окрашенный препарат на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении;
9.     Микроскопировать с иммерсионной системой.

Результаты окраски: миелопероксидаза дает положительную реакцию в виде желтого или желто-коричневого окрашивания.

Оценка результатов цитохимических реакций.

При цитохимических реакциях необходимо определить характер цитохимических реакций – слабая, умеренная, интенсивная, с указанием процента положительно реагирующих клеток.

С этой целью применяют полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Принцип его заключается в оценке интенсивности окраски и числа положительных гранул при анализе 100 клеток:

0- отсутствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция;
+ - слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ - диффузная окраска цитоплазмы, наличие умеренного числа гранул;
+++ - интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски цитохимической реакции проводят расчет результатов в условных единицах или СЦК.

Вычисление среднего цитохимического коэффициента по формуле Astaldi и Verga: 3хС+2хВ+А

Оценка результатов в условных единицах по методике Karlow:
СЦК = (3хС+2хВ+А) / 100, где
А – количество клеток со слабоположительной реакцией;
В – количество клеток с умеренно положительной реакцией;
С – количество клеток с резко выраженной реакцией.
При этом показатель активности реакций в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а СЦК – от 0 до 3%