М.Н. Зенина ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики МАПО, г. Санкт-Петербург Цитохимия, как направление гистохимии, изучает химическую природу клеточных структур, распределение химических соединений внутри клетки и их превращения в связи с функцией клетки и ее отдельных компонентов [4]. Основоположником гистохимии считают французского фармацевта, ботаника и микроскописта Франсуа Винсента Распайля (1794–1878 гг.), открывшего многие гистохимические реакции, которые не потеряли своей актульности и сегодня. Однако прошло более ста лет, прежде чем цитохимические исследования начали проводиться систематически и продуктивно. Существенным прогрессом в этой области явилось применение анилиновых красителей (конец XIX – начало XX вв.). Цитохимические методы (определение активности миелопероксидазы, окраска липидов суданом черным В) в гематологии эмпирически начали применяться в первой четверти XX в. Теоретические основы диагностической цитохимии гемобластозов заложены значительно позже – в исследованиях И.Ф. Сейца и И.С. Лугановой, основные результаты их исследований отражены в монографии “Биохимия клеток крови и костного мозга в норме и при лейкозах”. Эти ученые впервые показали существование фундаментальных химических и метаболических отличий различных по степени зрелости трансформированных клеток миелоидного и лимфоидного происхождения при хронических лейкозах. Систематическое изучение цитохимических особенностей наименее дифференцированных бластных клеток проведено Hayhoe с соавт. и отечественными гемоцитологами Э.И. Терентьевой, Л.И. Казановой, В.Т. Морозовой, В.Б. Лецким, И.С. Петерсон, Р.В. Ленской [2]. Современная цитохимия основана на химических цветных реакциях, выявляющих в клетках специфические вещества и ферменты. Лейкозные клетки сохраняют свойства своих нормальных аналогов; выявление этих свойств и, благодаря этому, принадлежности лейкозных бластов к определенному клеточному типу, способствует установлению формы острого лейкоза, что необходимо для проведения адекватной и эффективной терапии. Международный совет по стандартизации в гематологии (International Council for Standardization in Haematology – ICSH) рекомендовал для диагностики острых лейкозов исследование диагностически значимых ферментов: ~ миелопероксидаза; ~ неспецифические эстеразы (α-нафтилацетат-эстераза), кислая неспецифическая эстераза, хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D- хлорацетат-эстераза); ~ кислая и щелочная фосфатазы; и субстанций: ~ липиды (СЧ); ~ гликоген (PAS-реакция) [7]. Цитохимические методы просты в исполнении, информативны и не требуют использования сложной аппаратуры. В настоящее время фирмой ”АБРИС+” выпускаются готовые цитохимические наборы, позволяющие быстро воспроизвести методику и оценить полученные результаты. Приготовление мазков Для цитохимических исследований мазки готовят непосредственно из аспирационного материала (костного мозга, периферической крови, лимфатического узла) без добавления антикоагулянта. Если нельзя соблюсти эти условия из-за быстрой сворачиваемости, материал помещают в антикоагулянт (ЭДТА, оксалат, цитрат, гепарин). Предпочтение отдается гепарину, вызывающему наименьшие морфологические изменения лейкоцитов [1]. Оптимальные режимы фиксации, необходимые для сохранения структурных компонентов клеток и закрепления исследуемых веществ в местах прижизненного их расположения, приведены в инструкциях к применению цитохимических наборов. Количественная оценка Полученные результаты оцениваются полуколичественным методом, с вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Приступая к микроскопии, в каждом отдельном мазке при обзорном просмотре выбирают эталоны – клетки, содержащие исследуемое вещество. Отсутствие окраски цитоплазмы принимается за нулевую степень. Наличие в цитоплазме небольшого окрашенного участка, составляющего 1/4 часть всей цитоплазмы, соответствует интенсивности реакции 1-й степени (А). Окрашивание 8/10 цитоплазмы принимается за 2-ю степень насыщения (В). При 3-й степени интенсивности реакции исследуемое вещество заполняет всю цитоплазму и даже выявляется на ядре. Затем, как при подсчете лейкоцитарной формулы, в разных участках мазка подсчитывают, не пропуская, 100 однотипных клеток и рассчитывают процентное содержание клеточных элементов с различной интенсивностью реакции. Показатель активности в условных единицах вычисляется по формуле (Astаldi,Verga, 1975 г.): 3С + 2В + А. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) вычисляется по формуле (по Kaplow): СЦК = 3С+2В+А 100 При вычислении показателя активности, клетки с интенсивностью 0 исключаются; к проценту клеток с интенсивностью 1 (А) прибавляется процент клеток с интенсивностью 2 (В), умноженный на коэффициент 2 и количество клеток с интенсивностью 3 (С), умноженное на коэффициент 3. Показатель активности в условных единицах от 0 до 300, СЦК 0–3% [5]. Ферменты Миелопероксидаза Принцип цитохимического метода определения миелопероксидазы основан на окислении бензидина в присутствии перекиси водорода в окрашенное нерастворимое соединение желтого цвета. Фермент определяется в 100% нейтрофилов и эозинофилов. При этом миелопероксидаза стабильно сохраняет свою высокую активность при выходе клеток из костного мозга. В моноцитах активность фермента проявляется почти во всех клетках, но интенсивность реакции невысока по сравнению с нейтрофилами. В лимфоцитах, плазмоцитах и клетках красного ряда активность миелопероксидазы не выявляется. Определение миелопероксидазы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-МПО. Неспецифические эстеразы В группу ферментов, гидролизирующих эфиры карбоновых кислот, входят неспецифические эстеразы. Для определения локализации этих ферментов пользуются методом азосочетания. Метод основан на том, что азокраситель, образующийся при сочетании освобождающихся при гидролизе α-нафтола с различными стабилизированными диазотатами, быстро осаждается в месте локализации фермента в нейтральной среде. Наиболее изученные эстеразы – это хлорацетатэстераза (нафтол-AS-D-хлорацетат-эстераза) и α-нафтилацетат-эстераза. Хлорацетатэстераза отличается избирательностью ее выявления в клетках гранулоцитарного ряда и в части моноцитов. Максимум активности фермент достигает в промиелоцитах. Выявляется в виде темно-фиолетовых гранул, локализованных в цитоплазме. В лимфоидных и плазматических клетках, в эозинофилах активность хлорацетатэстеразы не выявляется. Определение хлорацетатэстеразы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ХЭ. α-нафтилацетат-эстераза наибольшей активности достигает в промиелоцитах, по мере созревания клеток активность этого фермента падает. Наибольшую активность α-нафтилацетат-эстеразы имеют моноциты крови и костного мозга. Характерной особенностью этой реакции в моноцитах является почти полное ее подавление ингибитором – фтористым натрием. В лимфоцитах активность α-нафтилацетатэстеразы невысока (1–5 гранул в клетке). Определение α-нафтилацетат-эстеразы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-НЭ. Щелочная фосфатаза – гидролитический фермент с оптимумом действия при рН 9,2–9,6. Метод определения основан на ферментативном гидролизе нафтилфосфата натрия и реакции освобождающегося нафтола с солью диазония. При этом в участке фосфатазной активности образуется осадок синтезированного азокрасителя. Фермент содержится преимущественно в нейтрофильных лейкоцитах. Определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью на- бора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-ЩФ. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом с оптимумом действия при рН 5,0. Кислая фосфатаза содержится во всех клетках крови. Для клеток миелоидной направленности дифференцировки характерно диффузное окрашивание, при этом наименьшая активность обнаруживается в зрелых нейтрофилах. Наибольшей активностью обладают эозинофилы и моноциты. Значительное диффузное окрашивание выявляется в мегакариоцитах и плазматических клетках. Гранулярное окрашивание – в лимфоцитах и ядерных клетках красного ряда. Определение кислой фосфатазы в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-КФ. Гликоген Наличие гликогена в клетке определяют с помощью ПАС- или ШИК-реакции (шифф-йодная кислота) – окисление гликогена йодной кислотой до диальдегидов, которые, взаимодействуя с реактивом Шиффа, образуют нерастворимый продукт красного цвета. Гликоген наблюдается во всех морфологически идентифицируемых миелоидных клетках в виде мелких гранул, расположенных плотно в цитоплазме и на поверхности ядер. Лимфоциты содержат меньше гликогена, чем гранулоциты, но в их цитоплазме часто выявляют ПАС-положительные гранулы. Они могут быть разной величины и их число значительно варьирует. Определение гликогена в лейкоцитах возможно с помощью набора ДИАХИМ- ЦИТОСТЕЙН-ПАС. Для полуколичественной оценки содержания гликогена в клетках используются следующие градации: 0 – в цитоплазме нет материала; + – рассеянные гранулы, или “венчик” из 1 ряда гранул; ++ – венчик из 2 рядов гранул; +++ – венчик из 3 и более рядов гранул или блоков. Оценивают 100 клеток, сумма дает итог от 0 до 300. Липиды локализуются в цитоплазме клеток и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах, для выявления которых пользуются суданом черным В. Выявление липидов основано на способности красящих веществ растворяться в жирах. Определение липидов в лейкоцитах с помощью судана черного В возможно с помощью набора ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН-СЧ. Современные цитохимические методы исследований применяются в онкогематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов крови, костного мозга, лимфатических узлов. Различные клеточные линии в цитохимических реакциях демонстрируют неодинаковый характер окраски. Таким образом, цитохимический маркер дает возможность выявить направленность дифференцировки кроветворных клеток. Использование вышеназванных цитохимических методов в большинстве случаев бывает достаточным для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток и определения варианта острого лейкоза. При определении активности миелопероксидазы интенсивная положительная реакция наблюдается в миелобластах, слабая или отрицательная — в монобластах, лимфобласты остаются неокрашенными. При окрашивании бластных клеток суданом черным В получают данные, дополняющие результаты определения активности миелопероксидазы. Положительная реакция при выявлении активности хлорацетатэстеразы отмечается только в миелобластах. Реакция на неспецифическую эстеразу является маркерной для монобластов и более зрелых клеток моноцитарно/макрофагального ряда. Обнаружение гликогена в виде крупных гранул или блоков в цитоплазме характерно для бластов лимфоидного происхождения. Определение кислой фосфатазы в виде крупной гранулы или пятна в одном участке цитоплазмы позволяет при остром лимфобластном лейкозе отличить бласты Т-клеточной природы от лейкемических клеток, возникающих из В-клеток-предшественников. При диагностике хронических миелопролиферативных заболеваний немаловажное значение имеет определение активности щелочной фосфатазы при сублейкемическом миелофиброзе, идиопатической полицитемии, бластном кризе хронического миелолейкоза и низкой активности фермента, вплоть до отрицательной реакции, при хроническом миелолейкозе [6]. В некоторых случаях цитохимические реакции позволяют определить принадлежность клеток к опухолевому клону (определение тартратрезистентной кислой фосфатазы при волосато-клеточном лейкозе). Результаты цитохимических исследований клеток крови при острых лейкозах легли в основу их классификации и способствовали внедрению в практику методов дифференцированной терапии [3]. Список использованной литературы 1. Бутенко З.А., Глузман Д.Ф., Зак К.П. Цитохимия и электронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов. Киев: Изд. “Наукова думка”, 1974. 2. Глузман Д.Ф., Скляренко, Л.М., Надгорная В.А. Диагностика опухолевых забо- леваний кроветворной и лимфоидной тканей // Здоровье Украины. 2004. № 94. С. 1–3. 3. Морозова В.Т. Лабораторная диагностика лейкозов. Л.: Медицина, 1977. С. 152. 4. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная. М.: Издательство иностран- ной литературы, 1962. С. 962. 5. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. М.: Медицина, 1983. С. 320. 6. Цитохимическая диагностика в лабораторной гематологии: Методическое руководство. Атлас. СПб., 2003. С. 38. 7. Scott C.S., Zen Ottolender J.Y., Swirscky D. et al. Recommended procedures for the classificasion of acute Leukamies // Leukemia and Lymphoma. 1993. V 11. Р. 37–500. Статья напечатана в журнале справочник заведующего КДЛ №4 опрель 2009 г.
