ДИАХИМ-ЦИТОСТЕЙН - СЧ Набор реагентов для определения фосфолипидов в лейкоцитах

ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ:

Приготовление мазков: 2-3 мазка крови (или костного мозга) сделать на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла следующим образом.

На сухое предметное стекло, ближе к короткой стороне наносят пипеткой небольшую каплю крови. Предметное стекло следует держать на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставить шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвинуть его вправо до соприкосновения с каплей крови. Выждать до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением провести его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1 - 1,5 см до его края. Нельзя сильно нажимать на стекло, так как многие клетки крови могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается “метелочкой”. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток. Затем надо уложить предметные стекла мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.

Фиксация препаратов: приготовленные препараты положить на лотки, выстланные фильтровальной бумагой и высушить при комнатной температуре в течение 15 – 30 минут. Высушенный на воздухе препарат зафиксировать в парах формалина при температуре 37° в течение 10 минут, после чего промыть проточной водой не менее 10 секунд

Приготовление буферного раствора: растворить навеску фосфата натрия в 25 мл дистиллированной воды. Отмерить 7,5 мл раствора карболовой кислоты. Соединить с 25 мл раствора фосфата натрия. Раствор сохраняет свои свойства в течение 3 месяцев при температуре 0 - +4°С.

Приготовление рабочего раствора судана черного: к 30 мл раствора судана черного В добавить 20 мл буферного раствора.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА:

1.    Предметные стёкла с зафиксированными препаратами поместить на штатив для окраски и на них налить свежеприготовленный рабочий раствор;
2.     Выдержать 60 минут при комнатной температуре;
3.     Ополоснуть в 70° этаноле 3 сек;
4.     Промыть дистиллированной водой в течение 5 секунд;
5.     Промокнуть фильтровальной бумагой;
6.     Докрасить раствором красителя Диахим-ГемиСтейн-Р («Профессионал»)- по Романовскому 15-20 мин;
7.     Промыть в проточной воде 10 секунд;
8.     Высушить на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении;
9.     Микроскопировать с иммерсионной системой.

Результаты:

Фосфолипиды дают положительную реакцию в виде черного или черно-коричневого окрашивания, не растворимого в воде.

Нормальные величины:

Большинство нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей красятся интенсивно, 18-36% дают окраску средней интенсивности и 10% слабо окрашены.

СЦК в нейтрофилах 2,65-0,033.

Фосфолипиды обнаруживаются в виде коричнево-черных гранул в клетках гранулоцитарного ряда, начиная со стадии миелобласта. Наиболее богаты липидами зрелые гранулоциты, в цитоплазме которых липиды (суданофильный материал) расположена в основном в перинуклеарной зоне. В моноцитах редкие суданофильные гранулы рассеяны по всей цитоплазме.

В эозинофилах суданоположительное вещество локализуется по периферии специфических гранул, с неокрашенной центральной зоной, реакция в базофилах вариабильна.

Лимфоциты и их предшественники реагируют отрицательно. Также отрицательно реагируют тромбоциты и мегакариоциты и эритробласты. Мегакариоциты изредка могут демонстрировать диффузное окрашивание, на фоне которого рассеяны очень мелкие суданофильные гранулы в цитоплазме и над ядром.

Липиды являются более чувствительным маркером миелоидной дифференцировки. В соответствии с ФАБ-классификацией критериями диагностики острых лейкозов для подтверждения миелоидной природы бластов необходимо выявление 3% и более бластных клеток, положительных по липидам.

Оценка результатов цитохимических реакций.

При цитохимических реакциях необходимо определить характер цитохимических реакций – слабая, умеренная, интенсивная, с указанием процента положительно реагирующих клеток.
С этой целью применяют полуколичественный метод оценки результатов в условных единицах или вычислением среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Принцип его заключается в оценке интенсивности окраски и числа положительных гранул при анализе 100 клеток:
0- отсуствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция;
+ - слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ - диффузная окраска цитоплазмы, наличие умеренного числа гранул;
+++ - интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски цитохимической реакции проводят расчет результатов в условных единицах или СЦК.

Вычисление среднего цитохимического коэффициента по формуле Astaldi и Verga: 3хС+2хВ+А

Оценка результатов в условных единицах по методике Karlow:
СЦК = (3хС+2хВ+А) / 100, где
А – количество клеток со слабоположительной реакцией;
В – количество клеток с умеренно положительной реакцией;
С – количество клеток с резко выраженной реакцией.

При этом показатель активности реакций в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а СЦК – от 0 до 3%